Баркодирование

За последние несколько лет систему CRISPR/Cas9, казалось, попробовали применить во всех направлениях генной инженерии. С помощью этого мощнейшего инструмента редактировали геномы хозяйственно важных животных и растений, вредителей, переносчиков инфекций, модифицировали метаболические пути промышленно важных микроорганизмов. Разумеется, самые активные разработки ведутся в области применения CRISPR/Cas9 в медицине. Однако этот инструмент имеет не только прикладное значение, но и может пригодиться ученым, занимающимся фундаментальной наукой. В начале августа 2018 года Science опубликовал статью, авторы которой использовали CRISPR/Cas9 для отслеживания судьбы отдельных клеток в ходе развития организма мыши. О деталях этой замечательной работы мы сегодня и поговорим.

Отследить судьбы отдельных клеток в ходе развития сложного многоклеточного организма — задача в высшей степени нетривиальная. Самый простой объект для этой задачи — эутелические организмы, число клеток которых постоянно и генетически определено, например, модельный червь Caenorhabditis elegans. Восстановить биографию каждой из его 959 клеток удалось довольно давно. Однако подавляющее большинство многоклеточных организмов свойством эутелии не обладают. Наиболее общая идея для отслеживания жизненных путей отдельных клеток заключается в том, что, если клетка приобрела некоторую мутацию, не отразившуюся на ее жизнеспособности, то все ее дочерние клетки тоже будут нести эту мутацию. Если эта клетка дает начало целой ткани или органу, то все клетки этой ткани или органа будут также нести ее мутацию. Иными словами, наличие специфической мутации в клеточном геноме будет свидетельствовать о происхождении этой клетки от той предковой клетки, в геноме которой впервые появилась эта мутация. Таким образом, с помощью мутаций-меток можно устанавливать происхождение каждой клетки организма от той или иной зародышевой структуры.

Идея, в общем-то, несложная, а вот ее осуществление — задача не из легких. Первоначально в качестве меток использовали определенные кусочки ДНК (штрихкоды, или баркоды), которые вставляли в геном клеток-прародительниц. Этот метод получил название баркодирования ДНК. Однако такое мечение статично: оно позволяет лишь увидеть картину в данный момент времени, а восстановить промежуточные этапы оказывается невозможным. Впоследствии разработали методы, с помощью которых удавалось вносить мутации в клетки в условиях in vivo, то есть определенные мутации-метки (баркоды) появлялись на определенных стадиях онтогенеза, а не были искусственно введены в самом начале эксперимента. С помощью такого подхода удалось не только пронаблюдать за последовательностью клеточных делений в культуре, но и поклеточно проследить за развитием низших позвоночных животных.

Про мини ПК:  Отправка кассового аппарата в розничный магазин; пошаговая инструкция

Разумеется, нам больше всего хочется узнать подробности развития нашего, человеческого, организма. Низшие позвоночные состоят с нами в слишком далеком родстве, чтобы данные об их развитии можно было экстраполировать на нас. Поэтому ученые задумались о том, как бы проследить за путями отдельных клеток при развитии млекопитающих. В случае млекопитающих и без того замысловатые методики осложняются еще и тем, что эмбриональное развитие протекает внутри организма матери, что делает манипуляции с эмбрионами крайне сложными.

Баркодирование

Рисунок 1. In vivo баркодирование ДНК с помощью hgRNA и стратегия получения мышей с множественными встройками hgRNA. а — Схема наследования маркерных мутаций (баркодов) при клеточных делениях. б — Схема строения комплекса самонаправленной направляющей РНК (homing guide RNA, hgRNA) и Cas9. в — Разнообразие мутантных аллелей, которое может появиться от исходного аллеля после воздействия Cas9 и репарации. г — Схема библиотеки конструктов, кодирующих hgRNA. Обратите внимание на инвертированные концевые повторы (ITR), благодаря которым транспозаза вставила их в геном. д — Схема эксперимента. После трансфекции и обработки транспозазой отобрали эмбриональные стволовые клетки с большим количеством вставок. Их внедрили в бластоцисты, которые имплантировали в матки самок. Из получившегося потомства выбрали особь с наибольшим числом вставок.

Однако в какие локусы вводить мутации, чтобы при этом не нарушить нормальное развитие животного? Ученые взяли мышиные эмбриональные стволовые клетки, растущие в культуре, и трансфецировали их ДНК-конструктами, представляющими собой транспозоны с вставленными в них генами направляющих РНК, а также подействовали на клетки ферментом транспозазой (рис. 1д). Каждый конструкт содержал полный набор элементов, которые должны быть в транскрипте, взаимодействующем в качестве направляющей РНК (guide RNA, gRNA) с Cas9: спейсер, содержащий уникальную нуклеотидную последовательность, PAM (protospacer adjacent motif) и скэффолд, необходимый для взаимодействия с Cas9 (рис. 1б). Стоит отметить, что конструкты отличались по степени того, в каком проценте клеток кодируемые ими направляющие РНК вместе с Cas9 вызывали мутации. По этому признаку конструкты условно подразделили на «быстрые» и «медленные» (рис. 1г). Транспозаза обеспечила интеграцию этих конструктов в геномы мышиных эмбриональных стволовых клеток. С помощью пуромицина отобрали клетки с большим количеством вставок. Их ввели в бластоцисты, которые, в свою очередь, имплантировали в матки самок. Из получившегося потомства отобрали мышь с наибольшим количеством вставок.

Про мини ПК:  Сканер штрих кода mindeo es4650

Анализируя совокупность баркодов отдельных клеток на разных этапах эмбрионального развития, исследователям удалось восстановить картину того, из каких зародышевых структур происходят те или иные органы. Результат совпал с общепринятыми представлениями, что подтвердило достоверность новой методики.

Поскольку методику разработали именно для поклеточного отслеживания развития тканей и органов, ученые решили с ее помощью пронаблюдать за развитием мозга. Им удалось выделить среди клеток мозга те, которые происходят от эктодермы, и клетки мезодермального происхождения. Они установили также, что нейроны определенной области одного полушария ближе к нейронам этой же области другого полушария, чем к нейронам из других областей своего полушария. Из этого следует, что в ходе развития мозга первой устанавливается передне-задняя ось, а лево-правосторонняя ось устанавливается позже.

Таким образом, разработанная методика на основе CRISPR/Cas9 позволяет наблюдать за развитием даже сложных многоклеточных организмов на уровне отдельных клеток. Несомненно, с ее помощью мы еще сможем узнать немало новых деталей о развитии многоклеточных животных.

  • Reza Kalhor, Kian Kalhor, Leo Mejia, Kathleen Leeper, Amanda Graveline, et. al.. (2018). Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. eaat9804;
  • Просто о сложном: CRISPR/Cas;
  • Как CRISPR/Cas работает не по специальности;
  • Анти-CRISPR: ответ вирусов;
  • Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов.

Генетические технологии, ворвавшиеся в человеческую жизнь в конце прошлого столетия, изменили наш мир настолько, что без них его уже невозможно представить. Не обошло это «поветрие» и криминалистику, где уже десятки лет генетическая идентификация используется как быстрый и относительно дешевый метод, позволяющий находить преступников и раскрывать их деяния, не выходя из лаборатории. Новая статья из цикла о криминалистике познакомит читателей с классическими генетическими подходами в этой сфере и осветит перспективы их дальнейшего развития.

Баркодирование

Криминалистика

Спецпроект посвящен криминалистике — науке, которая занимается расследованием преступлений.

Спонсор этой статьи — компания Thermo Fisher Scientific, мировой лидер в области науки с годовым доходом свыше 25 млрд $. Миссия компании — помочь клиентам сделать мир здоровее, чище и безопаснее. Глобальная команда, насчитывающая более 75 000 сотрудников, обеспечивает непревзойденное сочетание инновационных технологий, удобства закупок и фармацевтических услуг, востребованных клиентами. Ведущие брэнды компании: Thermo Scientific, Applied Biosystems, Invitrogen, Fisher Scientific, Unity Lab Services и Patheon.

В качестве рецензента этой статьи выступила Светлана Александровна Боринская — заведующая лабораторией анализа генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, специалист в области исследования генома человека и популяционной генетики.

Спецпроект выполнен в сотрудничестве со Следственным комитетом Российской Федерации. Куратор спецпроекта — старший эксперт отдела медико-биологических исследований судебно-экспертного управления Следственного комитета Российской Федерации Сергей Васильевич Кряжов. Вместе с ним эту статью рецензировала старший эксперт отдела медико-биологических исследований судебно-экспертного управления Следственного комитета Российской Федерации Анна Игоревна Баранова.

Также в качестве рецензента мы пригласили Елену Клещенко — биолога, научного журналиста и писателя, заместителя главного редактора портала PCR.news, автора книги «ДНК и её человек».

История синтеза, или Как стать рыцарем своей королевы

Первоначально работы с генетическим материалом проводили буквально на «коленке» и не всегда могли воспроизвести даже в соседней научной лаборатории. Но время шло, подходы менялись, а методы стандартизировались до такой степени, что постепенно внедрились в прикладные исследования и даже биотехнологические производства.

Новыми техниками анализа генетического материала заинтересовались и криминалисты. Дело в том, что привычные к тому времени методы классической дактилоскопии и анализа групп крови имели свои ограничения и в некоторых случаях давали осечки .

Баркодирование

Рисунок 1. Сэр Алек Джеффрис — британский генетик, разработавший технику ДНК-дактилоскопии

В 1984 году британский ученый Алек Джеффрис (рис. 1) разработал и представил метод идентификации личности человека с использованием его генетического материала. В дальнейшем этот подход получил название ДНК-дактилоскопии (или ДНК-идентификации), завоевав любовь и уважение у криминалистов всего мира. Джеффрис же за свою работу был посвящен в рыцари.

Преимущества и недостатки генетических методов

Проведение генетического анализа полученных на месте преступления биологических образцов во многом упростило работу следователей. Они получили надежный инструмент, позволяющий идентифицировать преступника или его жертву, добывать неоспоримые улики и раскрывать преступления.

Важно отметить, что классические методы ДНК-дактилоскопии не позволяют проводить идентификацию однояйцевых близнецов, генетический профиль которых одинаков, поскольку они формируются из одной оплодотворенной яйцеклетки .

Там, где не может справиться генетика, на помощь приходит эпигенетика! Использование эпигенетики в криминалистике позволяет решать некоторые задачи, недоступные «классической» генетике, в том числе возможность различения монозиготных близнецов. Подробнее об этом читайте в следующей статье нашего спецпроекта.

ДНК-дактилоскопия

В основе методов ДНК-дактилоскопии лежит генетическая изменчивость человека. Нуклеотидные замены в ДНК (в зависимости от частоты в популяции, их называют также ДНК-полиморфизмами, или мутациями) делают нас индивидуально различными. Причем эти отличия могут быть найдены как в ядерных, так и в митохондриальных геномах — небольших кольцевых молекулах ДНК, которые регулируют работу митохондрий, энергетических «фабрик» клеток.

Сбор и выделение ДНК из биологического материала

Выделение и анализ ДНК из криминалистических образцов на первый взгляд сопоставимы с искусством. Иногда невозможно представить себе, что несколько капель крови или частички кожи под ногтями жертвы могут стать важнейшей уликой при расследовании уголовного дела. На самом деле действия криминалистов на месте преступления отточены и проходят по единому сценарию, одна из основных целей которого — поиск биологического материала, пригодного для выделения (экстракции) ДНК. Для этого могут использоваться любые биологические ткани и выделения человека: костные останки, зубы, волосяные луковицы, кровь, эпителиальные клетки, пот, слюна, образцы спермы, экскременты и т.д.

Биоматериал на вещдоках может сохраняться десятилетиями. Зачастую для исследования эксперт отбирает только часть материала — столько, сколько ему нужно для выделения ДНК. Например, при наличии на ноже следов крови, эксперт не смывает всю кровь, а делает небольшой смыв непосредственно перед выделением ДНК. При этом на ноже остаются следы, по которым через несколько десятков лет удается провести повторную экспертизу.

В клеточном ядре ДНК находится в тесном контакте с многочисленными органическими молекулами, необходимыми для ее эффективного функционирования. Однако для проведения генетического анализа из исследуемого образца должны быть удалены углеводы, липиды и белки, которые могут снижать эффективность применяемых методов и, как следствие, влиять на раскрываемость преступлений.

Выделение ДНК занимает немного времени благодаря разнообразным коммерческим наборам и системам, специально разработанным для экстракции нуклеиновых кислот (например, AutoMate Express DNA Extraction System от Thermo Fisher Scientific). Кроме того, в крупных криминалистических центрах с тысячами анализов в день этот процесс полностью автоматизирован и проводится при участии роботов под надзором оператора. К слову, роботизированные системы получили широкое применение не только в криминалистических лабораториях, но и во многих медицинских и биотехнологических центрах, позволяя ускорить процесс, снизить себестоимость работ и значительно снизить вероятность ошибки.

После экстракции ДНК растворяют в специальном составе, где при необходимости она может храниться в течение многих лет (при температуре −20 °C или −80 °C).

Генетический анализ

Сразу после экстракции ДНК перед специалистом встает вопрос о дальнейших путях ее анализа. С момента внедрения ДНК-идентификации в криминалистику методы молекулярной биологии изменились настолько, что существует сразу несколько возможных их вариантов. Наш дальнейший рассказ будет освещать разнообразные техники анализа ДНК, которые эксперты-криминалисты используют в своей практике.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ)

Баркодирование

Рисунок 2а. Схема RFLP-анализа. а — Нанесение нарезанных рестриктазами ДНК-образцов в лунки геля. б — Электрофорез фрагментов ДНК (фрагменты меньшей длины мигрируют с большей скоростью в электрическом поле и наоборот).

изображения предоставлены автором статьи

Баркодирование

Рисунок 2б. Схема RFLP-анализа. Результаты RFLP-анализа ДНК шестерых человек. Как видно из иллюстрации, каждый человек обладает уникальным рестрикционным «рисунком», что помогает в идентификации личности.

Поскольку не существует полностью идентичных человеческих геномов (кроме однояйцевых близнецов), разница или сходство в получаемых профилях длин ДНК-фрагментов может быть неплохим маркером как для идентификации личности, так и для определения родства. Однако данный метод подразумевает фрагментацию ДНК, и потому он чувствителен к качеству и количеству исходного генетического материала. Поэтому в настоящее время RFLP-анализ практически не используется — в отличие от других методов, речь о которых пойдет ниже.

Анализ числа тандемных повторов в геноме

VNTR имеют длину от шести до сотни нуклеотидов; участки генома, где они расположены, могут достигать длины в несколько тысяч нуклеотидов. В последнее время VNTR в криминалистике практически не используются. Золотым стандартом ДНК-дактилоскопии сегодня считаются короткие тандемные повторы (STR).

Как и в случае с предыдущим методом, главным идентифицирующим фактором STR-анализа служит длина полученных фрагментов, которая уникальна для каждого человека и зависит от числа повторов в анализируемом участке. STR-анализ отличается высокой точностью и скоростью, а также низкой ценой. Важным условием для анализа выступает качество генетического материала.

STR-анализ появился в практической криминалистике почти двадцать лет назад, но и по сей день остается основным методом идентификации личности. Результаты анализа ДНK подозреваемых и преступников — генетические профили — криминалисты заносят в специальные базы данных. Поэтому при обнаружении на месте преступления биологических следов, из которых удается выделить ДНК, стало возможным идентифицировать всех людей, уже попадавших в поле зрения правоохранительных органов. Эти же маркеры используются для поиска пропавших без вести людей и для установления отцовства.

Как правило, системы, разработанные для идентификации личности, позволяют анализировать сразу несколько локусов генома (10–24), включая ген белка амелогенина, по которому определяют пол. Ген амелогенина есть и на X-хромосоме, и на Y-хромосоме, но различается размером, что позволяет установить пол человека.

ДНК-полиморфизмы, анализ Y-хромосомы и митохондриальной ДНК

Однако есть два компонента генома человека, которые рекомбинации не подвержены. Это Y-хромосома, определяющая мужской пол, и митохондриальная ДНК. Y-хромосома наследуется сыновьями от своих отцов, и выявленные в ней полиморфные локусы (SNP и STR) используют для построения родословной по мужской линии. Митохондриальная ДНК передается только по материнской линии и позволяет оценить родство между женщиной и ее потомками по женской линии — как женщинами, так и мужчинами. Но мужчины свою митохондриальную ДНК детям не передают, поэтому «женская линия» родословной на них обрывается.

Митохондриальная ДНК не так часто используется в криминалистике, но в некоторых случаях она имеет неоспоримые преимущества — например, при работе с плохо сохранившимися образцами, а также в тех случаях, когда необходимо установить родство по материнской линии. Она содержится в клетке в большом количестве копий, от десятков до тысяч, поэтому даже при разрушении ДНК ее все еще можно выделить и проанализировать. По сути, именно митохондриальная ДНК позволила предположить, что останки, найденные в начале 1990-х годов под Екатеринбургом, принадлежат членам царской семьи (подробности этой истории — ниже).

Из-за разнообразных мутаций геномы различных видов значительно изменились в процессе эволюции. Некоторые мутации вредны и зачастую отфильтровываются естественным отбором. Подавляющее большинство — нейтральны. Есть мутации, имеющие положительный эффект: они позволяют биологическому виду приобрести различные адаптации и завоевать экологические ниши. ДНК-различия между видами позволили разработать специальные тест-системы для их идентификации.

Секвенирование по Сэнгеру

Приборы, позволяющие проводить секвенирование по Сэнгеру, также применяют для визуализации и последующего анализа результатов фрагментного анализа (RFLP- и STR-анализы), о которых мы писали ранее.

Высокопроизводительное секвенирование (NGS)

  • Полупроводниковое секвенирование основано на регистрации локального изменения рН в момент удлинения синтезируемой цепи ДНК-полимеразой на матрице ДНК и реализована в приборах биотехнологической компании Thermo Fisher Scientific — Ion S5 / Ion S5 XL.
  • Секвенирование на молекулярных кластерах реализовано в приборах компании Illumina (MiniSeq, MiSeq, NextSeq и NovaSeq) и основывается на переводе информации о флуоресценции в ходе синтеза дочерней цепи ДНК в последовательность нуклеотидов.

Благодаря использованию технологий высокопроизводительного секвенирования криминалистика получила эффективный инструмент, который открыл новые возможности для одновременного анализа многочисленных участков (локусов) ядерного и митохондриального геномов. Важным плюсом этих методов является возможность отличать даже однояйцевых близнецов (по соматическим мутациям), что невозможно при проведении RFLP- или STR-анализов.

От теории к практике

Все озвученные выше методы ежедневно демонстрируют свою эффективность в раскрытии преступлений, и в том числе позволяют раскрыть некоторые исторические загадки.

Пожалуй, самое интересное исследование с использованием методов ДНК-дактилоскопии провела группа ведущего российского генетика Евгения Рогаева (рис. 6).

Баркодирование

Рисунок 6. Исследование под руководством Евгения Рогаева позволило установить принадлежность к царской семье обнаруженных под Екатеринбургом останков

В начале 1990-х годов в окрестностях Екатеринбурга нашли захоронение людей, которые, исходя из предварительного анализа, являлись членами царской семьи. Это предположение вызвало бурные споры, поскольку останки двух детей последнего русского царя не были идентифицированы. В 2007 году неподалеку от первого захоронения обнаружили обгоревшие останки еще двух человек — мальчика и молодой женщины (рис. 7).

Баркодирование

Рисунок 7. В 1991 году обнаружили захоронение членов царской семьи

Баркодирование

Рисунок 8. Анализ гетероплазмии в митохондриальных (материнских) линиях императора Николая II. Редкая гетероплазмия в позиции 16169 мтДНК послужила дополнительным доказательством того, что останки действительно являются останками Николая II.

Другие применения

Кроме идентификации человека ДНК-дактилоскопия находит применение во многих других аспектах криминалистических исследований. К ним относятся идентификация видов животных, растений и даже микроорганизмов.

Восстановление облика по ДНК

Стремительно развивающиеся новые технологии ДНК-дактилоскопии позволяют быстро и эффективно идентифицировать криминалистический материал. Развитие геномики, физической антропологии, методов магнитно-резонансной и компьютерной томографии, 3D-моделирования, а также нейросетевых алгоритмов сделали возможным восстановление облика человека по его биологическому материалу (рис. 10).

Баркодирование

Рисунок 10. Результат работы системы HIrisPlex, которая восстанавливает предполагаемый цвет глаз и волос человека на основе генетического анализа 24 SNP-маркеров. Следует знать, что развитие технологий не стоит на месте, и современные методы ДНК-фенотипирования позволяют оценить не только цвет волос или глаз, но и форму черепа, а также другие антропологические признаки.

Несмотря на то, что нейросетевые алгоритмы были предложены еще в ‘50-х годах прошлого столетия, до последнего времени их потенциал не был полностью раскрыт. Однако появление больших объемов данных и повышение скорости вычислений, позволившее использовать нейросети с большим количеством слоев, привело к качественному скачку их эффективности.

В 2012 году применение нейросетевого подхода снизило ошибку классификации изображений более чем на 10%, и уже к 2015 году нейросети превзошли человека в данной задаче. В это же время алгоритмы искусственных нейронных сетей получили широкое распространение в распознавании речи. Многослойные архитектуры получили название глубоких нейронных сетей, а за их использованием закрепился термин «глубокое обучение».

Развитие технологий считывания геномных данных, методов антропологического анализа, компьютерного 3D-моделирования, биоинформатических методов и нейросетевых алгоритмов позволяет обрабатывать значительные массивы геномной и антропологической информации и связывать ее, используя нейронные сети.

Прогнозирование фенотипа (внешнего облика) человека, используя его генетическую информацию, активно развивается и уже успешно применяется правоохранительными органами Соединенных Штатов.

После многочисленных этапов обучения нейронная сеть стала предсказывать не только этническую принадлежность или морфологические признаки (цвет глаз или цвет волос), но и воссоздавать облик человека по образцу ДНК, полученному с места преступления. Первоначально грубо, но в процессе продолжающегося самообучения, в том числе и положительного опыта криминалистической практики, эта технология эффективно участвует в воссоздании облика человека по оставленному им на месте преступления биологическому материалу.

Молекулярно-генетическая экспертиза — это крайне важный высокотехнологичный раздел криминалистики. Помимо того, что сегодня молекулярно-генетическая экспертиза является золотым стандартом криминалистики, она продолжает свое активное развитие как в виде самостоятельного направления, так и в синтезе с другими криминалистическими (и не только) дисциплинами. Благодаря работе экспертов-генетиков было и будет раскрыто еще множество дел и преступлений, а неизбежное совершенствование технологий открывает новые горизонты для использования молекулярной генетики в криминалистике.

Оцените статью
Карман PC
Добавить комментарий